В молекулярната биология, добрият избор на буфер и подготовката за различни стъпки на изолация на ДНК могат да бъдат разликата между преминаването към експресия на протеини или отварянето на друг макси-преп комплект, за да започнем отначало. Въпреки решаващата им важност, буферните рецепти често са точно това - рецепти, написани без обяснение или обосновка за различните компоненти. Един такъв буфер е глюкозо-трис-EDTA или GTE буфер.
$config[code] not foundЗа какво се използва GTE?
GTE се използва за ресуспендиране на бактериални клетъчни пелети преди лизирането (разчупването) на клетките и събиране на плазмидната ДНК вътре. Често се добавя лизозим, който омекотява клетъчните мембрани, заедно с буфера на GTE. Постигането на хомогенна суспензия на цели клетки по време на този етап, така че впоследствие добавеният лизисен разтвор може да достигне до всички клетки, е от ключово значение за получаване на добри добиви на ДНК. GTE е предназначена да направи това, като същевременно осигурява стабилна среда за ДНК.
Глюкоза за осмоларност
50 mM (милимоларна) глюкозна захар се добавя към GTE буфера за поддържане на осмоларността, където концентрацията на разтвореното вещество извън клетките е близка до тази вътре в клетките. Това предотвратява преждевременното клетъчно лизиране, което може да причини по-ниски добиви на ДНК поради агрегиране и разграждане. Другите компоненти на буфера също допринасят за осмоларността на разтвора, но глюкозата, която не е електролит, е добър избор, тъй като не пречи на буферните свойства на разтвора.
Tris за рН стабилност
Tris е краткото наименование за трис (хидроксиметил) аминометан, който е много обичаен буфер на рН. В случая на GTE буфер, киселинната сол (Tris-HCl) се добавя към буфера при концентрация от 25 тМ. Това поддържа рН на разтвора при почти физиологичен 8.0, идеално рН за предотвратяване на киселинна хидролиза (разграждане) на плазмидната ДНК и нежелани странични реакции на другите клетъчни компоненти.
EDTA предотвратява разграждането на ДНК
EDTA, или етилендиаминтетраоцетна киселина, улавя или "хелатира" метални йони извън разтвора, като им пречи да участват в нежелани странични реакции. В GTE буфер се добавя EDTA при 10 тМ. Неговата основна цел е в буфера за закръгляване на свободния цинк, магнезий и калций, като по този начин се предотвратява разграждането на ДНК от определени пътища, които изискват тези метали.
Някои важни съвети
Дръжте Вашия GTE буфер студен и го направете в малки количества, за да предотвратите появата на нежелани бактерии в него. Захарта и контролираното рН създават голяма среда за растеж. Винаги използвайте пречистена вода. Водата от чешмата може да има излишък от метални йони от тръбите, което може да надвиши способността на EDTA да улови. Ако подозирате наличието на интерферираща РНК в пробата, добавете RNase A на 100 микрограма на милилитър към вашия GTE буфер, за да елиминирате проблема.
